HPLC - umfassende Fachdarstellung zu Prinzipien, Praxis und Trends
Zuletzt aktualisiert: 14 Januar 2026
Der Begriff Hochleistungsflüssigkeitschromatografie kommt aus dem Englischen und steht für „high performance liquid chromatography“ (HPLC). Der Begriff „performance“ stellt dabei den modernen Standardbegriff dar, während der Begriff „pressure“ historisch genutzt wurde. HPLC bezeichnet die derzeit gebräuchliche Form der flüssigkeitschromatografischen Trennung, bei der eine mobile Flüssigphase unter hohem Druck (von typischerweise 50 bis 400 bar) durch eine mit stationärer Phase gefüllte Säule geleitet wird. Eine etablierte Beschreibung der Methode hebt die zielgerichtete Verteilung von Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase hervor, welche die Grundlage für zeitlich aufgelöste Peakprofile bildet.
Grundprinzip und Aufbau
Ein Chromatografiesystem gliedert sich in Pumpen, Probeninjektor, druckstabile Säule, Detektor und Datenerfassungseinheit. Zunächst wird die Probe in die mobile Phase eingebracht und anschließend transportiert die Pumpe den Lösungsmittelstrom durch die Säule. Je nach Trennmodus spielen hydrophobe, ionische oder sterische Wechselwirkungen eine Rolle. Detektoren messen jetzt die eluierten Fraktionen und wandeln diese in chromatografische Signale um, welche die Software zur Datenauswertung anschließend interpretiert und quantifiziert.
Probenvorbereitung und Einflussfaktoren
Saubere Proben sind die Voraussetzung für aussagekräftige Ergebnisse; deshalb reduzieren Filtration, Verdünnung, Extraktion oder die Festphasenaufreinigung auftretende Matrixeffekte und schützen dadurch die Säule. Zusätzlich beeinflussen der pH-Wert, die Ionstärke und der organische Anteil der mobilen Phase sowohl das Retentionsverhalten als auch die Peakform. Ferner regulieren Flussrate, Säulentemperatur und Partikelgröße die Trennleistung und bestimmen die Analysezeit sowie die Auflösung. Praxisnahe Entscheidungskriterien für die Probenvorbereitung ergeben sich aus der Matrixkomplexität sowie der geforderten Nachweisempfindlichkeit.
Trennmodi und Auswahlkriterien
Die Wahl des Trennmodus orientiert sich an der Polarität, dem Ladungszustand sowie der Molekülgröße der Zielsubstanz. Reversed-Phase-Verfahren gelten als Standard für organische und pharmakologisch relevante Moleküle, während sich die hydrophile Interaktionschromatografie (HILIC) für stark polare Verbindungen eignet. Zusätzlich erlauben Ionenaustauschmaterialien die selektive Separation geladener Spezies, während Größenausschlussverfahren makromolekulare Verteilungen abbilden. Für chirale Substanzen stehen spezielle stationäre Phasen zur Verfügung, welche die Enantiomeren trennen.
Kurzliste: Auswahlkriterien
- Polarität des Analyten und der Matrix
- Chemische Stabilität bei vorgegebenen pH- und Temperaturbedingungen
- Gewünschte Nachweisgrenze und benötigte Selektivität
Detektionstechniken und Hyphenation
Komplexe Detektoren erweitern die Aussagekraft sowie die Empfindlichkeit. Gebräuchliche Optionen sind dabei UV/Vis-, Fluoreszenz- und Refraktometer-Detektoren. Massenspektrometrische Kopplungen liefern strukturrelevante Massendaten und verbessern die Nachweisgrenzen erheblich. Moderne Interfaces und Ionisationsquellen optimieren zudem die Empfindlichkeit, reduzieren Störeffekte und ermöglichen präzise Identifizierungen in komplexen Matrizes.
Methodenentwicklung und Optimierungsstrategien
Ein systematisches Vorgehen beginnt mit einer Zieldefinition und einer anschließenden Risikoabschätzung. Anschließend erfolgen Screening-Experimente zur Säulen- und Mobilphasenfindung, gefolgt von Parameteroptimierungen zu Flussrate, Temperatur und Gradientenzusammensetzung. Für zuverlässige Methoden bieten Design-of-Experiments-Ansätze (DoE), die zunehmend auch in regulatorischen Entwicklungsleitfäden (z. B. QbD) anerkannt sind, eine effiziente Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen Parametern zu identifizieren und das methodische Fenster zu bestimmen. Abschließend werden Kriterien für Systemtauglichkeit, Retentionszeitstabilität und Peakform festgelegt.
Validierung und regulatorische Anforderungen
Regulatorische Leitlinien verlangen eine dokumentierte Validierung der analytischen Verfahren hinsichtlich der Genauigkeit, Präzision, Linearität, Selektivität sowie der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. Bewährte Regelwerke wie die ICH-Leitlinie Q2(R2) und entsprechende FDA-Dokumente legen die erwarteten Prüfparameter fest. Ergänzend dazu definieren pharmakopöalische Monografien und nationale Kontrollstellen spezifische Akzeptanzkriterien, die im Rahmen von Freigaben und Inspektionen nachzuweisen sind.
Systemtauglichkeit (System Suitability)
Vor jeder Messreihe bestätigen Systemeignungstests die einwandfreie Funktion sowie die Leistungsfähigkeit des Geräts. Übliche Parameter sind dabei die theoretische Bodenzahl, Retentionszeitpräzision, Peakaufspaltung sowie das Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus sichern Kalibrierstandards und Kontrollproben die Rückverfolgbarkeit und ermöglichen eine frühzeitige Erkennung bei technischen Abweichungen. Eine konsequente Dokumentation dieser Prüfungen ist die Voraussetzung für auditsichere Abläufe.
Praktische Umsetzung in der Pharma- und Bioproduktion
Analytische Prüfmethoden begleiten den gesamten Herstellungsprozess, angefangen bei den Wirkstoffen bis hin zu den Arzneiformen. Vor der aseptischen Abfüllung dienen chromatografische Tests der Chargenfreigabe, der Kontrolle möglicher Abbauprodukte und der Bestätigung der Wirkstoffkonzentration. Integrierte Laborprozesse gewährleisten durch eine validierte Probenahme, dokumentierte Stabilitätsprüfungen und definierte Lagerbedingungen verlässliche Ergebnisse. Betriebsinterne Standard Operating Procedures (SOPs) regeln den Umgang mit kritischen Arbeitsschritten und unterstützen die regulatorische Nachvollziehbarkeit.
Qualitätssicherung, Datenintegrität und elektronische Systeme
Digitale Aufzeichnungssysteme erfassen alle chromatografischen Rohdaten, Integrationsparameter und Prüfprotokolle. Audit-Trails und ein Benutzerzugriffsmanagement, welches im Einklang mit 21 CFR Part 11 und EU-GMP Annex 11 steht, erhöhen die Datenintegrität, ohne dabei jedoch auf Backups und Langzeitarchivierungen zu verzichten. Regelmäßige Software-Validierungen sowie definierte Zugriffsrechte sichern die Reproduzierbarkeit und verhindern unautorisierte Änderungen.
Automatisierung, PAT und Digitalisierung
Eine Online-Probenaufbereitung, automatisierte Injektionssysteme und die Integration in Prozessanalytikplattformen (PAT), wie sie im Rahmen der FDA Process Analytical Technology-Initiative eingesetzt werden, ermöglichen eine kontinuierliche Überwachung und verbessern die Reaktionsmöglichkeiten.
In der pharmazeutischen Produktion – etwa im Umfeld aseptischer Abfüllung nach dem Rommelag-Blow-Fill-Seal(BFS)-Prinzip – unterstützt PAT die Echtzeitüberwachung kritischer Prozessparameter und trägt dazu bei, Abweichungen frühzeitig zu erkennen und die Prozessstabilität zu gewährleisten.
Ferner unterstützen moderne Algorithmen die Peak-Integration sowie Trendanalysen, wodurch Routineanalysen schneller und konsistenter ablaufen, was die Prozessstabilität in der Produktion kontinuierlich verbessert.
Troubleshooting: Häufige Probleme und Maßnahmen
Signalrauschen, Peakverbreiterung oder veränderte Retentionszeiten deuten auf Ursachen wie verstopfte Filter, falsch gemischte mobile Phase oder Säulenalterung hin. Die zu ergreifenden Maßnahmen reichen dabei von Systemtauglichkeitstests über Filterwechsel bis hin zur Überprüfung der mobilen Phase auf Kontaminationen. Bei persistierenden Problemen empfiehlt sich eine schrittweise Fehleranalyse, angefangen bei der Probenahme bis hin zur Datenauswertung.
Umwelt- und Sicherheitsaspekte
Der Lösungsmittelverbrauch, die Entsorgung organischer Abfälle sowie die Arbeitssicherheit beim Umgang mit toxischen Reagenzien sind entsprechend zu berücksichtigen. Reduzierte Lösungsmittelvolumina durch UHPLC (Ultra High Performance LC) mit Partikeln ≤ 2 µm und Drücken bis über 1.000 bar sowie effiziente Abfallmanagementsysteme verbessern die ökologische Bilanz sowie den Arbeitsschutz.
Als vielseitig einsetzbare Analytikplattform sichert die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie die präzise Trennung, Identifikation und Quantifizierung von Substanzen in Forschung und Routine. Durch die Kombination mit modernen Detektoren, stringenter Methodik und regulatorisch abgesicherter Validierung bleibt das Verfahren ein zentraler Punkt für die Qualitätssicherung in der Pharma-, Umwelt- und Lebensmittelanalytik. Darüber hinaus ermöglichen technologische Verbesserungen künftig eine höhere Effizienz, einen geringeren Verbrauch und eröffnen tiefere analytische Einsichten.